真空渗入转化法中农杆菌在植株体内的分布和活力变化

以真空渗入处理后的白菜植株为材料,采用组织化学染色法和细菌平板培养的方法,研究了农杆菌在植株体内的分布特点及其活力变化。结果表明：不同器官中农杆菌的分布量不同,以花器官中分布最多,叶中次之,茎中最少;农杆菌存在于细胞间隙中,维管束及其周围分布较集中,在胚珠中大量分布。处理后植株体内,各器官中农杆菌的生活力及其数量都随时间延长而减少,但是花器官中的农杆菌存活量较大,处理15d后的花蕾中仍然有一定量(约10.3个CFU/g组织)具有活力的农杆菌存在。讨论了这些研究结果在揭示真空渗入转化法的转化过程和提高转化频率中的意义。     

GFP-mTn融合蛋白对蓝猪耳生活细胞微丝骨架的标记

用农杆菌介导法将嵌合基因GFP-mTn(mTn是微丝结合蛋白Talin的微丝结合域,可以显示活体细胞中微丝的结构)导入蓝猪耳。经激光共聚焦显微镜观察了转基因植株的各种不同组织中融合蛋白的表达和分布情况。在叶片的表皮细胞、保卫细胞、根部的皮层细胞中有融合蛋白的不同程度表达。但仅在保卫细胞中微丝标记状况良好,显示基因表达的组织特异性。经光诱导处于开放态的气孔的保卫细胞微丝呈网状结构,在细胞内无规则分布;经黑暗诱导处于关闭态的气孔保卫细胞中微丝束沿保卫细胞纵轴排列,呈卷曲状分布,并观察到螺旋和环状的微丝结构。在转基因植株的其他部位,例如茎表皮细胞、根毛细胞和花粉粒中,未检测到目的基因的表达。本研究获得的转基因植株为研究气孔运动过程中微丝动态变化提供了有用的材料。     

奶山羊转基因供核细胞的再饥饿对核移植胚胎发育的影响

为提高转基因奶山羊体细胞核移植胚胎早期发育率,将经转染外源基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿培养(含0．5％FCS的DMEM)5天后分成两部分：第一部分细胞-80℃或液氮冻存,试验前复苏后直接用作供核细胞(试验组Ⅰ),或复苏后恢复培养(含10％FCS的DMEM)2-5天后再饥饿5天用作供核细胞(试验组Ⅱ);第二部分细胞作传代培养(含10％FCS的DMEM)2天后再饥饿5天用作供核细胞(试验组Ⅲ)。将上述不同处理的供核细胞进行细胞周期与存活率的检测,并将该供核细胞移入去除遗传物质的山羊MⅡ期卵母细胞的卵周隙内,经电融合、化学激活后,将核移植(NT)胚胎经0．8％琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内,培养6天后回收并观察NT胚胎的早期发育。结果,试验组Ⅱ所用供核细胞中G0／G1期细胞所占比例及其存活率分别为95．68％、99．9％,均显著地高于试验组Ⅰ(88、66％、80％);试验组Ⅱ的桑椹及囊胚期NT胚胎的发育率(66．09％)显著地高于试验组Ⅰ(22．00％)与试验组Ⅲ(50．5l％)。将以上发育的NT胚胎分别移入同步发情的受体后,35天作B超妊娠诊断,试验组Ⅱ的受体妊娠率为45．83％,显著地高于试验组Ⅰ(20．00％)与试验组Ⅲ(29．58％)。流式细胞仪分析结果表明,饥饿后的供核细胞经冷冻,复苏后恢复培养2-5天,再经饥饿处理,能显著地提高G0／G1期细胞的比例及细胞存活率;应用该细胞所组建的NT胚不仅具有较高的桑椹与囊胚期发育率,而且具有较高的受体妊娠率。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

苏云金芽胞杆菌cry26Aa和cry28Aa基因共表达可在芽胞外壁内侧形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种的伴胞晶体在预芽胞外壁内侧形成,呈现晶体芽胞粘连的现象。根据已发表的cry26Aa1和cry28Aa1基因序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02中扩增得到cry26Aa和cry28Aa基因,通过穿梭载体将这两个基因分别和同时转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,透射电镜下可在芽胞外壁内侧和外侧同时观察到伴胞晶体,而单独表达时可在芽胞外壁外侧观察到伴胞晶体。结果表明,伴胞晶体在芽胞外壁内侧表达不单独依赖于启动子的时空调控,可能还受到晶体蛋白相互作用的影响。     

外源β-胡萝卜素、光照对青霉PT95菌株菌核分化和类胡萝卜素产率的影响

初步研究了外源β-胡萝卜素和光照对青霉PT95菌株菌核分化和类胡萝卜素产率的影响。结果表明,在培养基中加入外源β-胡萝卜素后,PT95菌株渗出液出现的时间、菌核出现的时间延迟了,但菌核成熟的时间没变。培养基中的外源β胡萝卜素浓度越大,其渗出液、菌核出现的时间越迟。外源β胡萝卜素亦能降低PT95菌株的脂质过氧化水平和菌核中的类胡萝卜素含量。高氧胁迫的光照培养条件有利于PT95菌株的菌核分化和色素在菌核中的积累;与低氧胁迫的黑暗培养条件相比,其菌核生物量和类胡萝卜素产率分别增加了18.7%和101%。以上实验结果表明,若想获得高的菌核生物量和类胡萝卜素产率,应该尽可能在高氧胁迫、无抗氧化剂存在的条件下培养PT95菌株。     

通过特异PCR扩增和16SrDNA序列分析检测动弯杆菌

细菌性阴道病(Bacterial Vaginosis,BV)是由于细菌过度生长所致阴道微生态非正常改变,从而导致的一类多微生物病(Polymicrobial Diseases)。动弯杆菌(Mobiluncus sp．)与BV发生有密切关系,但该菌为厌氧菌,营养要求苛刻,很难进行纯培养,国内鲜有研究报道。本文先对BV动物模型恒河猴阴道分泌物进行厌氧菌混合培养,抽提混合物染色体DNA,之后设计了一对动弯杆菌16SrRNA基因的特异性引物,用PCR的方法扩增出了特异片段。通过对扩增产物进行测序分析,确定检测出的为动弯杆菌,并且与羞怯动弯杆菌极为相似。     

鼠伤寒沙门氏菌SL7207 SifA-突变株的构建和鉴定

鼠伤寒沙门氏菌SifA^-基因突变株的特点是能进入真核细胞的胞液。利用P22噬菌体转导技术构建了鼠伤寒沙门氏菌疫苗株SL7207的SifA^-突变株SL7207,该突变株与SL7207有着相似的体外生长曲线和细胞侵袭力,SL7207。在MDCK上皮细胞中的增殖能力增强,但在RAW264．7巨噬细胞中的生存能力减弱。小鼠毒力试验显示SL7207。在BALB／c小鼠体内毒力下降。仅SL7207在体外可向RAW264．7巨噬细胞递送真核表达质粒。SL7207的构建为重组沙门氏菌疫苗载体的研制提供了一个新的选择。     

化学诱导表达系统及其在植物中的应用

化学诱导启动子可以在特定时间和部位激活或抑制目的基因的表达。目前,已经建立了多种化学诱导表达系统,用于基因功能分析、无标记植物转化、特定位点DNA切除、育性恢复和RNA沉默等方面的研究。化学诱导表达系统为基础分子生物学研究和生物技术应用提供了强有力的工具,将大大加快植物转基因技术的应用。     

小鼠pαMHC-EGFP胚胎干细胞株的构建

应用电穿孔方法将含有α肌球蛋白重链启动子的pαMHC-EGFP载体转染到D3系小鼠胚胎千细胞,应用200μg／ml新霉素进行药物选择。采用悬浮培养法,体外诱导分化心肌细胞。荧光显微镜下,观察到第7天和第8天拟胚体中出现“跳动”的心肌细胞并同时有绿色荧光蛋白的表达。同时与D3系小鼠胚胎干细胞比较心肌细胞分化率的变化无显著差异（P〉0．05）。该细胞株在分化心肌细胞的同时,具有绿色荧光蛋白的标记,因而利于对心肌细胞的识别和纯化。